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【自有技术大讲堂】显微光学成像原理与技术

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一、 引言(yan)

 

显(xian)(xian)(xian)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)镜(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)是20世纪(ji)人类(lei)最伟大的(de)发(fa)明(ming)之一,最早的(de)显(xian)(xian)(xian)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)镜(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)是由两块(kuai)凸(tu)透镜(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)组成(cheng),用(yong)(yong)于观察微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)小(xiao)生物(wu)。随(sui)着科学(xue)技(ji)术(shu)不断(duan)发(fa)展,人们对显(xian)(xian)(xian)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)镜(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)的(de)需(xu)求越(yue)来越(yue)大,尤其(qi)是在生物(wu)、医疗、生产制造业(ye)等领(ling)域。根据不同的(de)应用(yong)(yong)领(ling)域,可以分为光学(xue)显(xian)(xian)(xian)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)镜(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)与电子(zi)(zi)显(xian)(xian)(xian)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)镜(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)。光学(xue)显(xian)(xian)(xian)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)镜(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)主要(yao)由目镜(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)、物(wu)镜(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)、载物(wu)台和(he)反光镜(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)组成(cheng),主要(yao)有如下几种类(lei)型(xing)的(de)显(xian)(xian)(xian)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)镜(jing)(jing)(jing)(jing)(jing):生物(wu)显(xian)(xian)(xian)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)镜(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)、荧(ying)光显(xian)(xian)(xian)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)镜(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)、偏光显(xian)(xian)(xian)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)镜(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)、体视显(xian)(xian)(xian)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)镜(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)和(he)共聚焦显(xian)(xian)(xian)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)镜(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)等。电子(zi)(zi)显(xian)(xian)(xian)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)镜(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)利用(yong)(yong)电子(zi)(zi)束(shu)成(cheng)像,相较于光学(xue)显(xian)(xian)(xian)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)镜(jing)(jing)(jing)(jing)(jing),具(ju)有更高的(de)成(cheng)像分辨率和(he)放大倍率。

 

二、 显(xian)微光学成像原(yuan)理

 

 

显微(wei)成(cheng)(cheng)像(xiang)(xiang)系(xi)统由物镜(jing)(jing)和(he)目镜(jing)(jing)组成(cheng)(cheng),物体(ti)AB处(chu)于物镜(jing)(jing)1倍(bei)至2倍(bei)焦(jiao)距(ju)处(chu),物镜(jing)(jing)对(dui)(dui)物体(ti)AB成(cheng)(cheng)倒立的放大(da)的实(shi)像(xiang)(xiang)A1B1,实(shi)像(xiang)(xiang)A1B1处(chu)于目镜(jing)(jing)1倍(bei)焦(jiao)距(ju)内,目镜(jing)(jing)对(dui)(dui)实(shi)像(xiang)(xiang)A1B1成(cheng)(cheng)正立的放大(da)的虚(xu)像(xiang)(xiang)A2B2,相对(dui)(dui)于物体(ti)AB,成(cheng)(cheng)一个倒立的放大(da)的虚(xu)像(xiang)(xiang)。不同的物镜(jing)(jing)和(he)目镜(jing)(jing)的焦(jiao)距(ju)大(da)小以(yi)(yi)及相对(dui)(dui)距(ju)离可(ke)以(yi)(yi)改变显微(wei)成(cheng)(cheng)像(xiang)(xiang)系(xi)统的放大(da)倍(bei)率,实(shi)现各(ge)种尺寸特征的显微(wei)成(cheng)(cheng)像(xiang)(xiang)。

 

显微镜(jing)参数: 数值孔径(jing)NA:光(guang)学系(xi)统的(de)一个(ge)(ge)无量纲(gang)的(de)数值,用于衡(heng)量该系(xi)统能够收集(ji)光(guang)的(de)角(jiao)(jiao)度范围,决定了系(xi)统的(de)空间分辨率(lv),NA=n*sinα,α为孔径(jing)角(jiao)(jiao)。 分辨率(lv)σ:光(guang)学系(xi)统能分辨两(liang)个(ge)(ge)临近点(dian)的(de)极(ji)限距离,σ=0.61λ/NA,λ为波长。 放大倍率(lv)τ:τ= ,为光(guang)学筒长,、分别(bie)为物镜(jing)和目镜(jing)的(de)焦距。

 

三、 显微镜类型

 

普(pu)通光(guang)学显微(wei)镜(jing):主要(yao)用于生物(wu)研(yan)究与(yu)物(wu)理学实验室,可以选(xuan)配固定放大(da)倍(bei)(bei)(bei)率(lv)的显微(wei)物(wu)镜(jing)或者连续变倍(bei)(bei)(bei)的显微(wei)物(wu)镜(jing),常见的放大(da)倍(bei)(bei)(bei)率(lv)为1倍(bei)(bei)(bei)到100倍(bei)(bei)(bei)。

 

偏光显微(wei)镜(jing):用于研究透明与不(bu)透明各向异性材(cai)料的(de)一种显微(wei)镜(jing),利用偏振光鉴别物质的(de)单折(zhe)射(she)率或者(zhe)双折(zhe)射(she)性,在(zai)地质学等(deng)理(li)工科专业中有(you)重(zhong)要应用。

 

微分(fen)(fen)干涉(she)相衬显微镜(jing):用于观察(cha)具有(you)(you)立(li)体(ti)结构的(de)微小(xiao)物体(ti),利用偏(pian)振(zhen)片和Wollaston棱(leng)镜(jing)将光(guang)束分(fen)(fen)为寻常光(guang)与非寻常光(guang),两束光(guang)受(shou)物体(ti)高度(du)信息(xi)调制而产生光(guang)程差,最(zui)终呈现出(chu)具有(you)(you)立(li)体(ti)感的(de)图像,相对于普通光(guang)学(xue)显微镜(jing),能更快速的(de)观察(cha)物体(ti)的(de)三维(wei)信息(xi),下图的(de)小(xiao)凸点(dian)清(qing)晰可见。

 

 

激光共聚(ju)焦显微镜:用于更高(gao)分辨(bian)率成(cheng)像(xiang),利(li)用一对(dui)共轭针孔进行(xing)“空间(jian)滤波”,将(jiang)焦平(ping)面(mian)以(yi)外的(de)(de)(de)杂(za)散光滤除以(yi)提高(gao)纵(zong)向分辨(bian)率,实现非侵入式的(de)(de)(de)“光学切(qie)片”。当所观(guan)察(cha)(cha)的(de)(de)(de)对(dui)象较厚时,传统的(de)(de)(de)荧光显微镜无(wu)法(fa)接收焦平(ping)面(mian)以(yi)外的(de)(de)(de)信息。激光共聚(ju)焦显微镜用激光作为光源,采用共轭聚(ju)焦原理和(he)装置,并利(li)用计算机对(dui)所观(guan)察(cha)(cha)的(de)(de)(de)对(dui)象进行(xing)数字图(tu)像(xiang)处理观(guan)察(cha)(cha)、分析和(he)输出。 其特点是可以(yi)对(dui)样品(pin)进行(xing)断层扫(sao)描(miao)和(he)成(cheng)像(xiang),进行(xing)无(wu)损伤观(guan)察(cha)(cha)和(he)分析物体(ti)的(de)(de)(de)三维空间(jian)结构。

 

 

超分(fen)辨显微(wei)镜(jing):传统的显微(wei)镜(jing)分(fen)辨率受制于光(guang)学衍射极(ji)限,一(yi)般的可见(jian)光(guang)照(zhao)明显微(wei)镜(jing)分(fen)辨率的极(ji)限为200纳米(mi)。利(li)用结构光(guang)照(zhao)明显微(wei)术(shu)(Structured Illumination Microscopy, SIM)、受激辐射耗尽显微(wei)术(shu)(Stimulated Emission Depletion Microscopy, STED)和(he)单分(fen)子定位和(he)构图技术(shu)(Single Molecule Localization and Composition)可以突(tu)破衍射极(ji)限,使得(de)光(guang)学分(fen)辨率达到(dao)20-30纳米(mi)。

 

四、 总结

 

显(xian)微镜在(zai)日常(chang)生活(huo)、生产(chan)制造(zao)、医疗科学等(deng)(deng)领域的(de)(de)(de)应用(yong)需求(qiu)越(yue)来(lai)越(yue)多。随着检(jian)测对象偏向微米(mi)纳(na)(na)米(mi)级,在(zai)保证足够的(de)(de)(de)放大倍率(lv)的(de)(de)(de)同时,仍(reng)需具有高(gao)(gao)的(de)(de)(de)分(fen)(fen)辨(bian)(bian)率(lv)。电子显(xian)微镜采用(yong)电子束成像的(de)(de)(de)方法,分(fen)(fen)辨(bian)(bian)率(lv)可(ke)(ke)高(gao)(gao)达(da)0.2纳(na)(na)米(mi);超分(fen)(fen)辨(bian)(bian)显(xian)微成像的(de)(de)(de)分(fen)(fen)辨(bian)(bian)率(lv)可(ke)(ke)达(da)20-30纳(na)(na)米(mi);普通显(xian)微镜的(de)(de)(de)分(fen)(fen)辨(bian)(bian)率(lv)可(ke)(ke)达(da)200纳(na)(na)米(mi),然而高(gao)(gao)分(fen)(fen)辨(bian)(bian)率(lv)的(de)(de)(de)显(xian)微镜往往伴随着小(xiao)视场与(yu)高(gao)(gao)成本等(deng)(deng)劣势,因此可(ke)(ke)以(yi)针对不同的(de)(de)(de)应用(yong)需求(qiu)选择(ze)合适的(de)(de)(de)显(xian)微镜。

2021年9月28日 10:47